Protilátky kuřecího žloutku (IgY) blokují vazbu více variant spike proteinu SARS-CoV-2 na lidský ACE2
Článek si můžete poslechnout v audio verzi ZDE:
Publikováno 3.11.2020 v National Library of Medicine
ZDROJ: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7608017/
Abstraktní
Virus SARS-CoV-2 se stále šíří po celém světě a existuje naléhavá potřeba účinně předcházet a kontrolovat tuto pandemii. Tato studie hodnotila potenciální účinnost protilátek ve vaječnému žloutku (IgY) jako neutralizačního činidla proti SARS-CoV-2. Zkoumali jsme neutralizační účinek anti-spike-S1 IgY na pseudovirus SARS-CoV-2 a také jeho inhibiční účinek na vazbu koronavirových spike proteinových mutantů na lidský ACE2. Naše výsledky ukazují, že anti-Spike-S1 IgY vykazovaly významnou neutralizační schopnost proti pseudoviru SARS-CoV-2, různým mutantům spike proteinů a dokonce i SARS-CoV in vitro. Mohl by to být proveditelný nástroj pro prevenci a kontrolu probíhajícího COVID-19.
1. Úvod
Probíhající pandemie COVID-19 způsobená těžkým akutním respiračním syndromem-koronavirem SARS-CoV-2, novým kmenem koronavirů, se od konce roku 2019 rychle rozšířila a vyvíjela [1] . K dnešnímu dni má SARS-CoV-2 na svědomí více než 40 milionů infekcí a více než 1,1 milionu úmrtí souvisejících s COVID-19 po celém světě. Je znepokojivé, že proti SARS-CoV-2 stále nejsou dostupné vakcíny ani antivirotika.
Předchozí studie ukázaly, že spike (S) glykoproteinový homotrimer na povrchu SARS-CoV-2 hraje zásadní roli ve vazbě na lidský ACE2 receptor a invazi viru [2] . Neutralizační protilátky proti spike glykoproteinu SARS-CoV-2 proto představují nejslibnější přístup proti COVID-19. Kromě toho bylo od pacientů v rekonvalescenci izolováno několik neutralizačních protilátek, které se zaměřují na receptor vázající doménu (RBD) SARS-CoV-2 [3] . Navzdory pokroku čelí použití monoklonálních protilátek v léčbě COIVD-19 široké škále bezpečnostních hrozeb, které je třeba ještě řešit [4].. Kromě toho vysoké výrobní náklady a nízký výtěžek mohou komplikovat použití neutralizačních protilátek, zejména v rozvojovém světě. Proto je potřeba prozkoumat další strategie, které by mohly být ekonomicky vhodnější a proveditelnější v boji proti prevenci a kontrole COVID-19.
První zpráva o protilátkách proti vaječnému žloutku (IgY) jako neutralizační látce proti tetanovému toxinu byla publikována v roce 1893 [5] . O tři roky později Behring a S. Kitasato objevili difterický antitoxin (v roce 1901 Nobelova cena za fyziologii a medicínu). Použití IgY nezískalo klinický význam a široké uplatnění až do příchodu principu 3R, který poprvé popsali Russell a Burch v roce 1959. IgY získaly více pozornosti pro své stabilní chemické vlastnosti, nízkou cenu, vysoký výnos. Důležitější je, že IgY se nevážou na lidské revmatoidní faktory, ani neaktivují systém lidského komplementu, což minimalizuje riziko zánětu [6].. Jako pasivní imunitní činidlo proti virovým a bakteriálním onemocněním mají IgY potenciál vyrábět funkční potraviny a nové léky. Čínským veterinárním lékopisem bylo schváleno několik přípravků IgY pro léčbu husího moru, kachního moru a dalších onemocnění. Protilátky IgY byly také použity k boji proti lidským virovým infekcím, jako je respirační syncyciální virus (RSV), chřipkový virus a virus Coxsackie. V jedné studii byly anti-SARS koronavirové IgY purifikovány z kuřat, která byla imunizována inaktivním SARS koronavirem, a IgY protilátky byly schopny neutralizovat SARS koronavirus in vitro i in vivo [7] .
Zde jsme purifikovali anti-spike-S1 IgY ze slepic, které byly imunizovány doménou S1 spike proteinu SARS-CoV-2, a zkoumali jsme jejich schopnost neutralizovat pseudovirus SARS-CoV-2 pomocí buněk Hela s nadměrně exprimovaným lidským ACE2. Kromě toho jsme použili kompetitivní testy ELISA k ověření kompetitivní vazby IgY na různé mutanty Spike proteinu SARS-CoV-2 a také Spike protein SARS-CoV.
2. Materiály a metody
2.1. Příprava a kvantifikace anti-S1 IgY
Sekvence DNA kódující S1 proteinu Spike SARS-CoV-2 byla kodonově optimalizovaná a syntetizovaná společností GenScript USA, Inc ( doplňkový materiál s). Gen byl poté subklonován do vektoru pFastBac1 pro expresi hmyzích buněk pomocí Bac-to-Bac® baculovirového systému. Spike-S1 SARS-CoV-2 s optimalizovaným kodonem byl exprimován v hmyzích buňkách Sf9 za použití expresního systému bakulovirus/hmyzí buňka ( obr. SI ). Purifikovaný rekombinantní protein SARS-CoV-2 S1 byl smíchán a emulgován s Freundovým imunitním adjuvans ve stejném objemu a poté použit jako imunogen. Každé slepici bylo injikováno (intramuskulárně) 150 μg rekombinantního spike proteinu pod křídla, jednou týdně po dobu 4 týdnů, a poté byl IgY extrahován a vyhodnocen titr. Zde jsme přijali vylepšenou extrakci, jak ji popisuje Sock HweeTan[8] , s mírnou úpravou pro následné zpracování. Odstranili jsme lipidy a lipoproteiny a pak jsme supernatant vysráželi s konečnou koncentrací 15% studeného ethanolu místo síranu amonného. Čistota extrahovaných IgY byla více než 80 %, bez zbytku síranu amonného a proces trval méně než 2 hodiny ( obr. S2 ). Odstřeďování by navíc mohlo být nahrazeno filtrací, díky čemuž je proces extrakce vhodnější pro průmyslovou velkovýrobu. Titr extrahovaného IgYs byl kvantifikován nepřímou ELISA. Stručně, jamky destičky ELISA byly potaženy rekombinantním SARS-CoV-2 Spike-RBD proteinem exprimovaným v HEK 293 buňkách, poté byla do jamek přidána sériová ředění IgY a ředění 1:10000 HRP-konjugované kozí anti-IgY byla přidána protilátka.
2.2. Neutralizační test pseudovirů
Blokující účinnost IgY na pseudovirus SARS-CoV-2 byla hodnocena luciferázou generovanou luminiscencí. Zde byly monoklonální buňky Hela s nadměrně exprimovaným ACE2 infikovány lentivirem nesoucím spike protein SARS-CoV-2 a luciferázový reportérový gen (GenScript Co., Nanjing, Čína). Schopnost IgY neutralizovat antigen byla hodnocena provedením testu neutralizace pseudoviru, jak uvádí luciferázový reportérový gen ( doplňkové materiály ).
2.3. Soutěžní ELISA
Použili jsme kompetiční ELISA k vyhodnocení schopnosti IgY inhibovat vazbu osmi různých mutantů spike proteinu koronaviru (včetně sedmi spike proteinů SARS-CoV-2 a jednoho spike proteinu SARS-CoV) na lidský ACE2. SARS-CoV-2 RBD nebo mutanty RBD ( tabulka S2 ) byly inkubovány přes noc při 4 °C v 96jamkové destičce s vysokou vazbou. Sériové ředění purifikovaného IgY a 0,3 ng/jamku Fc značeného lidského ACE2 (kat. č. AC2-H5257, ACROBiosystems) byly přidány do potažené destičky a poté inkubovány po dobu 1 hodiny při 37 °C. Jako sekundární protilátka byla přidána HRP-konjugovaná anti-lidská Fc (1:20000) (kat. č. 109-035-098, Jackson ImmunoResearch). OD450 byly odečteny čtečkou destiček. Všechna data byla analyzována pomocí GraphPad Prism 8.
3. Výsledky
Výsledky ukázaly, že ELISA titr IgY dosáhl 2 [10] po třetí posilovací dávce. Data testu neutralizace pseudoviru ukázala, že hodnoty IC50 pro anti-(SARS-Cov-2) IgY byly 270,5 μg/ml, s maximální inhibicí 75,86 %. Na druhé straně kontrolní IgY neměly žádný zřejmý inhibiční účinek, což naznačuje, že anti-(SARS-Cov-2) IgY měly neutralizační aktivitu (Obr. 1 ). Avšak ve srovnání s uváděnými monoklonálními protilátkami byla hodnota IC50 pro IgY relativně vysoká. Tento fenomén jsme spojovali se skutečností, že stejně jako ostatní polyklonální protilátky pouze asi 10 % IgY specificky rozpoznávalo SARS-CoV-2 a podíl IgY s neutralizační aktivitou byl ještě nižší. Zatímco IC50 pro polyklonální IgY byla vysoká, teoreticky by IgY měly mít více míst pro neutralizační aktivitu.
Křivka rychlosti inhibice luminiscence anti-(SARS-Cov-2) IgY (modrá) a normální (kontrola) IgY (červená) z testu neutralizace pseudoviru. (Pro výklad odkazů na barvu v této legendě obrázku se čtenář odkazuje na webovou verzi tohoto článku.)
Anti-(SARS-Cov-2) IgY vykazovaly zřejmou kompetici s ACE2 ve vazbě jak divokého typu SARS-Cov-2 (IC50 = 309,9 μg/ml), tak spike proteinů SARS-Cov (IC50 = 617,9 μg/ml). Kromě toho IgY také vykazovaly kompetitivní vazbu na šest mutantů spike proteinu SARS-Cov-2 [9] (W436R, R408I, N345D, V367F, N345D/D364Y a dominantnější mutant D614G) [10] s rozsahem IC50 324,0 −490,9 μg/ml (Obr ).
Kompetitivní inhibice osmi mutantů spike proteinu koronaviru, jak bylo stanoveno kompetitivní ELISA.
4. Závěr
Stručně řečeno, anti-Spike-S1 IgY vykazovaly významnou neutralizační schopnost proti pseudoviru SARS-CoV-2, různým S mutantům a dokonce i SARS-CoV in vitro . Bezpečnost a účinnost IgY však stále vyžaduje další zkoumání na zvířecích modelech.
V současné době se virus SARS-CoV-2 stále šíří po celém světě a pro prevenci a kontrolu pandemie je třeba udělat mnoho. Užívání IgY v aerosolových nebo sprejových formulacích na dýchací cesty, dutinu ústní a dokonce i trávicí trakt může být užitečnou strategií. Mohlo by to zabránit invazi viru SARS-CoV-2 přirozenou cestou infekce. Dlouhodobá kontrola SARS-CoV-2 však bude vyžadovat kombinaci nástrojů aktivní a pasivní imunizace, medikamentózní terapie a dalších preventivních opatření.
Financování
Tato práce byla podpořena granty Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grants No BK20180224) a Natural Science Foundation for Young Scientists of Jiangsu Province (Grants No BK20160362).
prohlášení o autorském příspěvku CRediT
Shuangshi Wei: Konceptualizace, Metodologie, Formální analýza, Psaní – originální návrh, Získání finančních prostředků. Shengbao Duan: Metodologie, psaní – recenze a úpravy. Xiaomei Liu: Formální analýza, Psaní – původní návrh. Hongmei Wang: Software. Shaohua Ding: Software. Yezhou Chen: Ověření. Jinsong Xie: Software. Jingjing Tian: Ověření. Nong Yu: Zdroje, metodika, vyšetřování. pingju Ge: Metodika. xinglin Zhang: Vyšetřování. Xiaohong chen: Ověření. Yong Li:Konceptualizace, supervize, získávání finančních prostředků. Qinglin Meng: Metodika, získávání finančních prostředků.
Poznámky pod čarou
Příloha A Doplňující údaje k tomuto článku lze nalézt online na https://doi.org/10.1016/j.intimp.2020.107172 .
Podobné články
-
Int Immunopharmacol. listopad 2022;112:109280. doi: 10.1016/j.intimp.2022.109280. Epub 2022, 28. září.PMID: 36183680 Volný článek PMC.
-
Mutace v spike proteinu a variacích alel v ACE2 ovlivňují strategie cílené terapie proti SARS-CoV-2.
Zool Res. 18. března 2021;42(2):170-181. doi: 10.24272/j.issn.2095-8137.2020.301.PMID: 33738989 Volný článek PMC. -
Nové lidské neutralizační mAb specifické pro Spike-RBD SARS-CoV-2.
Sci Rep. 2021 26. května;11(1):11046. doi: 10.1038/s41598-021-90348-7.PMID: 34040046 Volný článek PMC. -
J Appl Microbiol. březen 2022;132(3):2421-2430. doi: 10.1111/jam.15340. Epub 2021, 3. listopadu.PMID: 34706134 Volný článek PMC.
-
Možná inhibice produkce GM-CSF vakcínami na bázi hrotů SARS-CoV-2.
Mol Med. 22. května 2021; 27 (1): 49. doi: 10.1186/s10020-021-00313-3.PMID: 34022793 Volný článek PMC.
Citováno podle
-
Protilátky proti SARS-CoV-2 specifickému imunoglobulinu Y chrání u infikovaných myší.
PLoS Pathog. 19. září 2022;18(9):e1010782. doi: 10.1371/journal.ppat.1010782. eSbírka 2022 záříPMID: 36121829 Volný článek PMC. -
Toxiny (Basilej). 4. července 2022;14(7):459. doi: 10,3390/toxiny14070459.PMID: 35878197 Volný článek PMC.
-
J Genet Eng Biotechnol. 6. července 2022; 20 (1): 98. doi: 10.1186/s43141-022-00368-7.PMID: 35792966 Volný článek PMC. Posouzení.
-
Jedinečný antigen proti SARS-CoV-2, Acinetobacter baumannii a Pseudomonas aeruginosa.
Sci Rep. 2022 Jun 27;12(1):10852. doi: 10.1038/s41598-022-14877-5.PMID: 35760825 Volný článek PMC. -
Front Immunol. 1. června 2022;13:899617. doi: 10.3389/fimmu.2022.899617. eSbírka 2022.PMID: 35720389 Volný článek PMC. Klinická studie.
Reference
-
- Klemperer F. Uber natirliche Immunitat und ihre Verwertung fur die Immunisierungs-therapie. Oblouk. Expl. Pathol. Pharmakol. 1893;31:356–382.
-
- Tan SH, Mohamedali A., Kapur A., Lukjanenko L., Baker MS Nový, nákladově efektivní a účinný postup čištění IgY slepičích vajec. J. Immunol. Metody. 2012;380:73–76. – PubMed